產品簡介

線粒體活性氧產生速率(ROS)測試盒熒光法試驗需自備的儀器和用品：多功能酶標儀、恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、冰、蒸餾水。

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定。

商品屬性：

測定意義：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物等，研究表明，機體95％以上的活性氧（ROS）都來自于線粒體，其失衡所致的氧化應激與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程有關。

正常情況下，細胞內抗氧化防御系統與氧自由基處于平衡狀態，細胞內活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細胞內抗氧化系統與氧自由基的平衡被打破，細胞內活性氧水平過多，就可破壞線粒體酶類、脂類和核酸，使機體出現氧化應激，同時，活性氧還可攻擊線粒體DNA產生氧化損傷，導致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結構和功能變化。

因此，通過檢測活性氧的變化來判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測定原理：

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴散通過線粒體膜，在線粒體內被酯酶水解，形成無熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據上述原理設計了利用熒光法直接定量檢測線粒體ROS產生速率的方法。將熒光強度隨時間變化的數據點擬合，線性回歸直線斜率與ROS產生的速率呈正比。

需自備的儀器和用品：

多功能酶標儀、恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液一：液體25mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存。

試劑二：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體14μL×1支，4℃保存。

組織樣本的前處理：

①總GAPDH酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇 7s，總時間1min），然后 4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體GAPDH酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間 1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中GAPDH酶活性。

建議測定總GAPDH酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。細菌或培養細胞的前處理先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（3）在1mL石英比色皿中加入30μL樣本、20μL試劑三和950μL工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄 340nm處20s時的吸光值A1和5min20s后的吸光值。

A2，計算ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.144×ΔAV 反總：反應體系總體積，1×10-3L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

生化檢測試劑盒實驗操作說明：

一、抗氧化系列生化檢測試劑盒

包括氧化酶（XO）活性分析、超氧陰離子清除能力分析、葡萄糖氧化酶活性（GOD）檢測、總抗氧化能力（TAC）檢測、植物原花青素(OPC)含量檢測、植物類黃酮含量檢測、植物總酚（TP）含量檢測試劑盒。

氧化酶（XO）活性分析試劑盒為例，提供了一種簡單易用的比色分析法，用于測定各種樣品中的XO活性，特點是測定血清，血漿，組織/細胞裂解物和其他生物體液中的氧化酶活性，以及廣泛的檢測范圍：15.6-500mU/mL。

二、氧化系列生化檢測試劑盒

包括過氧化氫酶 (CAT) 活性分析、過氧化氫（H2O2）檢測、脂質過氧化(丙二醛) 分析、蛋白質羰基含量檢測、超氧陰離子含量檢測等試劑盒。

蛋白質羰基含量檢測試劑盒（比色法）為例，提供了一種簡單易用的比色法，用于分析不同生物樣品（細胞/組織裂解液，生物液體）中蛋白質羰基含量。在370 nm處有特征吸收峰。

特點是：

1.測定組織樣本、細胞、細菌、血清等中的蛋白質羰基含量。

2.樣本處理、實驗步驟以及結果計算更加詳盡準確精煉。

3.保質期長。

三、抗逆系列生化檢測試劑盒

包括超氧化物歧化酶 (SOD) 活力檢測、羥自由基清除能力分析、多酚氧化酶（PPO）活性檢測、過氧化物酶(POD)活性檢測等試劑盒。

超氧化物歧化酶 (SOD) 活力檢測試劑盒為例，提供一種簡單易用的比色測定法，用于定量測定血清，血漿，組織/細胞裂解液和其它生物體液中的SOD酶活性。

特點是：

1.測定血清，血漿，組織/細胞裂解物和其他生物體液中的SOD酶活性。

2.通過WST-8法測定SOD活性，最大抑制率可接近100％，不受一些常見干擾因素的干擾。

3.廣泛的檢測范圍：3.13- 200U/mL。

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